آنزیم های برش دهنده :
یکی از کشفیات مهمی که در پیشرفت مهندسی ژنتیک نقش مهمی داشت و تولید DNA نوترکیب را ممکن ساخت ، شناخت آنزیمهای برش دهنده بود.
*********
اولین آنزیم برش دهنده در 1950 کشف گردید. این آنزیمها وسیلهی دفاعی باکتریها در مقابل باکتریوفاژها میباشند و آنها را با مکانیسمی تحت عنوان «محدود کردن کنترل شدهی میزبان»
(host controlling restriction )
از ابتلا به عفونتهای باکتریوفاژی مصون میدارد.
***********
این مکانیسم به این صورت است که باکتری با تولید آنزیم
برش دهنده، DNA فاژ را قبل از آنکه فرصت همانندسازی و تکثیر یابند، تجزیه میکند. اما سوالی که در اینجا وجود دارد این است که آیا مادهی ژنتیک باکتری توسط آنزیم برش دهندهای که خود تولید کرده تحت تاثیر قرار نمیگیرد؟
تجزیهی DNA باکتری سبب مرگ سلول و تخریب آن میشود از این رو سلول برای مصون ماندن در مقابل حملهی آنزیمی که خود تولید میکند مکانیسم متیلاسیون DNA را به کار میبرد به این ترتیب آنزیم، دیگر قادر به شناسایی توالیهای DNA و حمله به آن نمیباشد.
***********
آنزیمهای برش دهنده از گروه آنزیمهای اندونوکلئاز میباشند و همانند قیچی DNA را در محلهای ویژهای با ترتیب بازی خاص قطع میکنند و برای آنکه DNAقابل برش با آنزیم باشد لازم است که دارای این ترتیب ویژه باشد .
توالیهایی از DNA که به وسیلهی آنزیم شناسایی میشوند را « جایگاه تشخیص » (recognitionsites) میگویند که معمولاً 4-8 جفت نوکلئوتید دارد و عمدتاً «پالیندرومی» میباشند، یعنی هر دو رشته دارای توالی یکسان ولی عکس یکدیگر اند.
این آنزیمها توسط اکثر باکتریها تولید میشوند و تاکنون بیش از 1200 نوع از آنها شناسایی شده اند.
**********
اندونوکلئازها را از نظر شیوهی عملکردشان در سه گروه قرار میدهند که از آن میان نوع II در کلونینگ ژن کاربرد و اهمیت دارد چرا که آنزیمهای نوع II انتهای چسبنده تولید میکنند. در «انتهای چسبنده » یا stiky end ،که آنزیمهای نوع II آن را ایجاد میکنند، در انتهای هر قطعهی حاصل از برش، 2 تا 4 نوکلئوتید تک رشتهای و بدون مکمل باقی میمانند و از آنجا که میتواند با قطعهی مکمل خود جفت شود به آن انتهای چسبنده میگویند.